Exercice 1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d’une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) :
MM tr (min)
Aldolase 145000 10,4
Lactate déshydrogénase 135000 11,4
Phosphatase alcaline 80000 18,4
Ovalbumine 45000 26,2
Lactoglobuline 37100 28,6
1 – Calculer les volumes d’élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve – Que remarquez-vous ?
2 – Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l’aide du graphique précédent. Existe t’il une autre méthode pour déterminer la MM ?
Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l’acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isoélectriques de l’acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C.
On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7.
Question :
1 – Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-résine sont uniquement d’ordre électrostatiques).
Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH).
Questions :
1 – Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).
2 – Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d’ordre électrostatiques).
Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d’anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls :
CH2-CH3
/
-CH2-CH2- NH+
CH2-CH3
Questions :
1 – Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l’amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).
2 – Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).
Exercice 5 : Le coefficient de partage de l’iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d’iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4).
Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l’eau.
Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l’eau, après agitation et décantation
Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d’une protéine p par chromatographie d’exclusion. La limite d’exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.
L’étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d’élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :
MM (Da) Ve (ml)
Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132
Questions :
1 – Rappeler à quoi correspond le Dalton.
2 – La protéine p montre, quant à elle, un volume d’élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM.
MM tr (min)
Aldolase 145000 10,4
Lactate déshydrogénase 135000 11,4
Phosphatase alcaline 80000 18,4
Ovalbumine 45000 26,2
Lactoglobuline 37100 28,6
1 – Calculer les volumes d’élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve – Que remarquez-vous ?
2 – Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l’aide du graphique précédent. Existe t’il une autre méthode pour déterminer la MM ?
Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l’acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isoélectriques de l’acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C.
On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7.
Question :
1 – Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminé-résine sont uniquement d’ordre électrostatiques).
Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH).
Questions :
1 – Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76).
2 – Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d’ordre électrostatiques).
Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d’anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls :
CH2-CH3
/
-CH2-CH2- NH+
CH2-CH3
Questions :
1 – Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l’amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4).
2 – Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques).
Exercice 5 : Le coefficient de partage de l’iode (I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d’iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4).
Donnée : I2 est plus soluble dans le tétrachlorométhane que dans l’eau.
Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l’eau, après agitation et décantation
Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d’une protéine p par chromatographie d’exclusion. La limite d’exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.
L’étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d’élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant :
MM (Da) Ve (ml)
Dextran 2000000 45
Fibrinogène 340000 60
Catalase 230000 75
Lactoglobuline 19000 132
Questions :
1 – Rappeler à quoi correspond le Dalton.
2 – La protéine p montre, quant à elle, un volume d’élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM.
